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单细胞scRNA-seq分析思路总结

  • ~5.79K 字
  1. 1. 具体流程
    1. 1.1. 数据准备与质控 (QC)
    2. 1.2. 标准化与特征选择
    3. 1.3. 降维
      1. 1.3.1. Harmony
      2. 1.3.2. ComBat (from sva package)
      3. 1.3.3. Seurat v4 的多模态整合 (FindMultiModalNeighbors)
      4. 1.3.4. MNN (Mutual Nearest Neighbors)
      5. 1.3.5. PCA + Batch Regressing (经典方法)
    4. 1.4. 邻居图构建与聚类
    5. 1.5. 细胞类型注释
    6. 1.6. 下游分析
    7. 1.7. 可视化与验证

单细胞分析思路，把常见的步骤和逻辑框架讲清楚。这里主要以 单细胞转录组（scRNA-seq） 为例。

具体流程

数据准备与质控 (QC)

  • 输入：原始 UMI/reads 矩阵（细胞 × 基因）。
  • 目标：筛掉低质量细胞，保证分析结果可靠。
  • 常见 QC 指标：
    • 每个细胞的总 reads/UMI 数（低了可能是坏细胞，高了可能是双细胞 doublet）。
    • 检测到的基因数。
    • 线粒体基因比例（过高说明细胞可能坏死）。
  • 操作：
    • subset、filter 去掉异常细胞。
    • DoubletFinder / Scrublet 识别双细胞。
具体方法
1
#TODO

标准化与特征选择

归一化 (Normalize)：

  • LogNormalize：每个细胞的 counts 除以总数 × scale.factor，再 log1p。
标准化意义
  1. 消除文库大小差异
  • 每个细胞的表达量变成“相对表达”，能直接比较不同细胞。
  1. 突出生物差异
  • 高表达的基因被 log 压缩，不至于主导后续分析；
  • 中低表达的差异会更明显，利于发现 marker 基因。
  1. 为下游分析提供可比性输入
  • PCA、聚类、UMAP 等方法都需要输入可比较的数值矩阵。
  • LogNormalize 后的矩阵能让算法真正捕捉生物学差异，而不是技术噪音。

高变基因选择 (FindVariableFeatures)：

  • 找出在细胞间变异度最高的一批基因（常用 2000）。
具体方法

🔬 Seurat 内置的三种方法

在 FindVariableFeatures() 里可以设置 selection.method：

  1. "vst"（Variance Stabilizing Transformation）👉 默认、推荐

  • 思路：

    • 对每个基因，在所有细胞里的表达做方差估计；
    • 把方差和均值之间的关系建模（负二项分布近似）；
    • 计算残差方差（observed variance / expected variance）。

  • 特点：

    • 在去除了均值依赖性后，能稳健地挑出高变基因；
    • 对高表达基因不会过度偏向；
    • 推荐作为大多数 scRNA-seq 分析的标准方法。
    1. "mean.var.plot"（MVP，均值-方差图方法）

  • 思路：

    • 把基因按均值分成 bins；
    • 计算每个基因在 bin 内的 z-score（方差相对 bin 内基因的偏高程度）；
    • 取方差最高的一批基因。

  • 特点：

    • 方法简单直观，可以画图展示（Mean-Variance Plot）。
    • 对噪音和批次效应敏感，不如 vst 稳健。
    1. "dispersion"（离散度方法）

  • 思路：

    • 类似于 MVP，但直接用 标准化后的方差/均值比（dispersion） 来挑基因。

  • 特点：

    • 速度快；
    • 但容易偏向于低均值、相对离散度高的基因。

缩放 (ScaleData)：

  • Z-score 标准化基因表达，用于 PCA 等。
what is Z-score

Z-score（标准分数、标准化值）是统计学里常用的一个指标，表示一个数值偏离平均值多少个标准差。

公式：

z=x−μσz=\frac{x−μ}{σ}

x：某个观测值

μ：总体/样本的平均值

σ：总体/样本的标准差

在单细胞分析里的应用

  • 在 高变基因筛选（mean.var.plot 方法） 中，Seurat 会把基因按表达均值分成 bins：
    • 先算每个基因的方差；
    • 再和同 bin 内的基因比较，用 z-score 标准化，得到它在该均值水平下是否“比平均更离散”。
  • 高 z-score → 说明这个基因在同水平基因里“更变异”，可能是高变基因。

z-score 就是“标准化的偏离程度”，告诉你一个值比均值高/低了多少个标准差。
在单细胞分析里，它常被用来比较基因在不同均值水平下的方差是否异常高，从而识别高变基因。

降维

线性降维 (PCA)：

  • 提取主要变异维度。

对于非同一批次的数据进行整合需对批次效应进行排除

常见的去除批次效应的方法

Harmony

  • 简介：Harmony 是一个非常强大的 批次效应校正工具，它通过在低维空间（通常是 PCA 空间）里对批次信息进行校正，迭代优化嵌入坐标，使得同一类型的细胞跨批次聚合，而不同类型的细胞仍然保持分开。

  • 使用方式：

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    obj <- RunHarmony(
        object = obj,
        group.by.vars = "batch",   # 批次信息
        reduction.use = "pca",     # 使用 PCA 空间
        reduction.name = "harmony",  # 输出降维名称
        dims.use = 1:30            # 使用的主成分数目
    )

  • 优点：

    • 通过 soft clustering 方法校正批次效应，而不仅仅是按批次分配。
    • 适用于大规模数据集，且处理速度较快。

  • 适用场景：

    • 数据来源于不同的批次、实验条件、平台或样本，需要整合成一个一致的低维表示。

ComBat (from sva package)

  • 简介：ComBat 是一种常用的 批次效应校正方法，基于 贝叶斯模型，用于从数据中去除批次效应。它通过调节每个基因在不同批次之间的均值和方差，使得不同批次之间的基因表达更加一致。

  • 使用方式：

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    library(sva)
    obj$batch <- as.factor(obj$batch)  # 批次信息列
    obj$gene_expression_corrected <- ComBat(
        dat = obj$RNA@data, 
        batch = obj$batch, 
        mod = NULL, 
        par.prior = TRUE, 
        prior.plots = FALSE
    )

  • 优点：

    • ComBat 方法是广泛应用于多组学数据的标准方法，适用于连续数据。
    • 在批次效应较为显著时效果明显。

  • 适用场景：

    • 批次效应较为明显且数据在实验设计中是 成对的（例如多次测量或不同的实验条件）。

Seurat v4 的多模态整合 (FindMultiModalNeighbors)

  • 简介：Seurat 提供了多模态数据整合的方法（例如 RNA + ATAC 或 RNA + ADT），可以通过 WNN（加权最近邻） 融合不同模态的数据，并在这个过程中去除批次效应。FindMultiModalNeighbors 会通过 加权相似度 减少不同模态之间的批次效应，同时保持每个模态在细胞分类上的表达差异。

  • 使用方式：

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    obj <- FindMultiModalNeighbors(
        object = obj,
        reduction.list = list("pca", "lsi"),  # RNA 使用 PCA，ATAC 使用 LSI
        dims.list = list(1:30, 2:30),           # 选定的维度数
        modality.weight.name = "RNA.weight",    # 设定权重名称
        verbose = TRUE
    )

  • 优点：

    • 无需在传统的 PCA/UMAP 上做批次效应校正。
    • 同时考虑多个模态，减少它们之间的批次效应。

  • 适用场景：

    • 多模态数据（如 RNA 和 ATAC、RNA 和 ADT）的整合，适用于跨批次、多模态的数据校正。

MNN (Mutual Nearest Neighbors)

  • 简介：MNN 是另一种批次校正方法，基于 互近邻（mutual nearest neighbors）进行批次校正。它通过对比批次间的最近邻，校正不同批次的样本，使其在低维空间中的表现更加一致。

  • 使用方式：

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    library(SingleCellExperiment)
    mnn_res <- MNNCorrect(obj, batch = obj$batch)  # 对象和批次信息
    obj$corrected_data <- mnn_res$corrected

  • 优点：

    • 能够处理不同批次数据之间的相对差异，保留生物学信号。
    • 可以应用于多个批次的整合。

  • 适用场景：

    • 当批次效应很大，尤其是多批次的情况下，适用于处理不同批次数据的整合。

PCA + Batch Regressing (经典方法)

  • 简介：经典的做法是通过 回归（regress） 在主成分（PCA）上去除批次信息。
    你可以在执行 PCA 前后，将批次信息作为回归变量，从数据中去除批次效应。

  • 使用方式：

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    obj <- ScaleData(obj, vars.to.regress = "batch")  # 在数据缩放时回归掉批次效应
    obj <- RunPCA(obj, features = VariableFeatures(obj))

  • 优点：

    • 非常简单，适合较小的批次效应。
    • 用于细胞类型之间没有太大差异的场景。

  • 适用场景：

    • 批次效应较小或已经知道批次信息，需要简单回归去除。

总结

排除批次效应的方法主要有：

  1. Harmony（适合大规模数据和多批次整合，批次校正和聚类都做）
  2. ComBat（基于贝叶斯模型，适用于批次差异较大的数据）
  3. Seurat 多模态整合（适用于 RNA 和 ATAC/ADT 等模态整合）
  4. MNN（适用于多批次数据的整合）
  5. PCA + 回归（经典方法，适用于批次效应较小的情况）。

非线性降维 (UMAP/tSNE)：

  • 用于可视化，把高维数据投射到 2D/3D。
undefined

对于单细胞RNA-seq而言，降维分析时先使用PCA提取变异的主成分这里有一些（可能是20？），再对得到的降维数据进行UMPA聚类。

邻居图构建与聚类

  • FindNeighbors：构建 kNN 图或 SNN 图。
What's KNN and SNN

KNN (“k-Nearest neighbors graph”)

定义：

  • 对每个细胞，找出在降维空间（如 PCA、LSI）里最接近的 k 个邻居。
  • 用这些邻居建立边 → 得到一个 KNN 图。

特点：

  • 边表示“几何上接近”；
  • 但仅靠 KNN 容易受局部噪音影响。

在 Seurat 里：

  • FindNeighbors() 默认先构建 KNN 图（存储在 obj@neighbors，一般名字是 RNA_nn 或 ATAC_nn）。

SNN（Shared Nearest Neighbors graph）

定义：

  • 在 KNN 图的基础上，看两个细胞的 邻居集合重叠多少。
  • 重叠越大 → 相似度越高 → 边的权重越大。
  • 用这个权重矩阵构建 SNN 图。

特点：

  • 比单纯的 KNN 更鲁棒：即使两个细胞不是直接最近邻，但如果它们共享很多邻居，也会被连在一起。

  • 常用于 聚类（比如 Seurat 的 Louvain/Leiden）。

  • 在 Seurat 里：

    • FindNeighbors(..., compute.SNN=TRUE) 会生成 SNN 图（一般名字是 RNA_snn 或 wsnn）。

一般情况下，先使用KNN对单细胞数据进行预处理，再使用SNN对KNN的数据进行聚类

  • FindClusters：基于图的社区检测算法（Louvain/Leiden），得到细胞簇。
  • 意义：把表达相似的细胞归为一群。

细胞类型注释

  • 找 marker 基因 (FindAllMarkers)：每个 cluster 的特异表达基因。
  • 对照已知 marker：推断 cluster 对应的细胞类型。
  • 可选：用参考数据库或自动化工具（SingleR, CellTypist）。

下游分析

根据研究问题不同，可能包括：

  • 差异表达分析 (FindMarkers)：比较不同 cluster / 条件下的基因表达差异。
  • 轨迹推断 (pseudotime)：Monocle/Slingshot 分析发育或分化轨迹。
  • 细胞通讯 (CellChat, CellPhoneDB)：预测细胞间配体-受体相互作用。
  • 基因调控网络 (SCENIC, pySCENIC)：推断转录因子活性。
  • 多组学整合 (WNN, MOFA+, Seurat v5)：整合 RNA、ATAC、ADT 等。

可视化与验证

  • UMAP/tSNE 图上展示 cluster/marker 表达。
  • 小提琴图、热图展示基因表达模式。
  • 对关键结果做实验验证（qPCR, FISH, flow cytometry）。

单细胞分析思路 = 质控 → 归一化 → 特征选择 → 降维 → 构图聚类 → 注释 → 下游分析（差异、轨迹、通讯等）。

它的核心是把高维 noisy 的单细胞数据，通过降维和聚类整理成有生物学意义的细胞群体，然后结合 marker/功能信息解读

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